Формирование ферментов с удаленными эффектами

Формирование ферментов с удалёнными эффектами

20 февраля 2010 г.

Инженеры навряд ли будут применять систему охлаждения, если хотят повысить размер машины. Все таки, химики из Института исследований угля им. Макса Планка приняли подобный подход в собственных усилиях по оптимизации фермента для использования на практике..

Они заменили две аминокислоты в относительно удаленном месте в отношении к сайту биокаталитического связывания, месту, где происходит хим. реакция. Эта модификация изменяет общую структуру фермента подобным образом, что теперь можно изменить ряд самых разных химических соединений..

Также, он предпочтительно даёт один из 2-ух вероятных энантиомеров, которые встречаются в виде рацемических смесей во время классического синтеза. Не обращая внимания на то, что они химически похожи, энантиомеры отличаются по собственной структуре как правые, так и левые. Лишь одна из 2-ух версий в большинстве случаев подойдет для применения в качестве медицинского активного вещества. Благодаря собственным изысканиям экспериментаторы из Max Planck смогли показать путь к новому подходу, который даст возможность преобразовывать ферменты с учетом потребностей химической и фармацевтической промышленности. (Раннее издание Труды Национальной Академии Наук, 27 января 2010 г.)

Ферменты работают достаточно надежно, но очень избирательно. Они преобразуют молекулы, которые появляются в природе, в точные формы, нужные для клетки или организма.

Но очень часто они превращаются всего в один химический ингредиент — к примеру, в автогараж, который специализируется только на ремонтных работах определенной автомобильной модели. Это важно в биологии, так как химические аберрации могут парализовать механизм биомолекул.

Химической и фармацевтической промышленности необходимы катализаторы, к примеру, ферменты, которые также обрабатывают молекулы, не встречающиеся в природе. Участвующие в этом ферменты постоянно являются энантиомерами, 2-мя с первого взгляда похожими соединениями, которые отличаются как правые, так и левые.

Сейчас химики встречаются с проблемой поиска катализаторов, которые дают возможность появиться лишь одной энантиомерной форме в процессе конверсии, другими словами катализатора, обладающего энантиоселективным действием. Иногда ферменты можно рассматривать как катализаторы для получения переходных соединений при помощи энантиоселективного синтеза для изготовления лекарственных средств. Однако данный процесс часто терпит неудачу, потому как фермент не может узнать форму энантиомера: всего один из 2-ух энантиомеров должен появиться в химреакции, потому как во многих случаях всего один проявляет желаемую биологическую активность..

Экспериментаторы из Института исследований угля имени Макса Планка создали фермент, который избирательно видоизменяет ряд молекул при помощи целенаправленной разработки. «То, что мы тут делаем, приводит к эволюции в пробирке», — говорит Манфред Т. Ритц, директор Института Макса Планка в Мюльхайме, возглавляющий текущую исследовательскую деятельность..

Подобным образом, химики делают варианты ферментов, понемногу меняя их структуру при помощи случайных мутаций. До этого ферменты уже были структурно модифицированы или образованы энантиоселективно, вызывая случайные мутации в активном центре, где происходит реакция. В настоящий момент они разработали принципиально иные стратегии. Впрочем фермент был изменен на участке, не вовлеченном в реальную реакцию. «Мы приняли другой подход, сфокусированный на эволюции и мутагенезе в комбинировании с здравым дизайном», — сказал Манфред Ритц..

Ритц и его коллеги начали с естественной монооксидазы Байера-Виллигера. Этот фермент окисляет молекулу субстрата, а если быть точным кетона, вставляя атом кислорода в точно конкретное положение. Продукт данного процесса — лактон. Селективно изготавливаемые лактоны Enantio хорошо ценятся среди соединений в химической и фармацевтической промышленности..

Естественная форма фермента часто работает абсолютно неселективно, другими словами она не может отличать энантиомеры, потому как две формы превращаются в сайт связывания с одинаковой скоростью. Ситуация еще более критична, когда искусственная молекула еще даже не преобразована, так как она не входит в сайт связывания. «Чтобы сделать больше этот сайт связывания для искусственных молекул, мы начали с поиска сайта в структурной модели фермента, изменения в котором меняют форму сайта связывания, даже в том случае, если он находится на относительно приличном расстоянии от сайта связывания», — объясняет Хуан Пабло Асеведо. Шэн Ву, принимающий прямое участие в преобразовании ферментов.

Они подозревали, что положение, в котором замена аминокислоты покажет замечательный эффект, находится в положениях 93 и 94 аминокислотной цепи. Опираясь на теоретических соображениях, химики поняли, что соответственная мутация должна вызывать структурные реструкуризации, из-за которых два домена, которые считаются 2-мя субъединицами фермента, перемещаются вместе: «Мы думаем, что сайты связывания возрастут, если мы перетащим эти два домена. ближе друг к другу », — говорит Хуан-Пабло Асеведо. Экспериментаторы достигли этого путем одновременной замены аминокислот в 2-ух сайтах новыми агентами с применением нечаянного насыщения мутагенеза. Сайт связывания практически возрастает, когда аспарагин вмонтирован в сайт глутамина в положении 93 и аспарагиновая кислота в сайт пролина в положении 94.

Потом фермент видоизменяет большой ряд самых разных веществ с высокой активностью, и встречается оригинально высокая активность. энантио избирательность. Ученым получилось одолеть то, что происходит тут узко: хотя больший участок связывания открывает фермент для более большого круга молекул субстрата, он в большинстве случаев также понижает его стереоконтроль при помощи реакций. Но сюда приехать не проблема.

Что намного важнее для экспериментаторов, так это то, что их подход как правило работает: они могут изменять форму реакционного центра, вызывая изменения структуры при помощи отдаленного мутагенеза. Биохимики уже знакомы с т.н. аллостерические эффекты, другими словами реструкуризация многих ферментов, сопровождающаяся изменениями структуры соответствующих сайтов связывания.

Впрочем эти эффекты вызываются маленькими молекулами, которые крепятся к ферменту вдалеке от сайта связывания. «Применяя методы генетической технологии, мы создали целевые аллостерические эффекты в ферменте, который в действительности не считается аллостерическим», — сказал Хуан Пабло Асеведо. Экспериментаторы из Мюльхейма уже иногда наблюдали далекие мутации во время направленной эволюции энантиоселективных ферментов. Впрочем до этого времени не получилось отнести их к аллостерическим эффектам..

Измененные ферменты появляются перепрограммированными бактериями. Экспериментаторы внедряют генетические карты вариантов природных ферментов в одноклеточный организм.

На данных картах они заменяют предложенные аминокислоты в одном или нескольких местах. Но взамен тестирования всех 20 аминокислот, из которых состоят белки, они применяют только двенадцать. «Этот коктейль собой представляет очень репрезентативную смесь структурно и электронно очень разных аминокислот», — объясняет Манфред Ритц. В теории монооксигеназа, которую он и его коллеги приняли в качестве модели фермента, имеет 144 варианта с разными комбинациями аминокислот в положениях 93 и 94. Чтобы действительно сберечь эти все варианты, ученым понадобилось вырастить около 400 колоний из смеси перепрограммированных бактерий, изолировать фермент от и проверить его характеристики.

В данном плане 400 вариантов — это немного. Если экспериментаторы не основательно выберут позиции, в которых изменения приведут к замечательному эффекту, и взамен этого применит «слепой» случайный мутагенез ко всему ферменту — подход, который активно применяется в направленной эволюции, — им, возможно, придется испытать как минимум пару сотен тысяч вариантов — очень много для того, чтобы метод был используем. для химической промышленности и биотехнологии. «Комбинируя рациональный дизайн и случайный мутагенез, мы можем существенно сделать быстрее разработку энантиоселективных и термостабильных ферментов», — говорит Манфред Ритц. Подобным образом он и его коллеги продолжат собственную последующую работу по конверсии ферментов. Потом он объединит изменение от сайта связывания с реорганизацией самого реакционного центра. «Мы надеемся, что это даст возможность нам достигнуть еще большей оптимизации ферментов», — говорит Манфред Ритц..

По материалам Источник

Похожие записи